一、柱体积的计算

我们在一些冲洗方法的资料中，经常会看到10倍柱体积或者20倍柱体积的说法。那么柱体积应该如何计算呢？我们可以把色谱柱想象为一个圆柱形，因此可以参考圆柱形计算公式。

V=πr²L

V=色谱柱体积(mL)  r=色谱柱半径(cm)  L= 色谱柱长度(cm)

常规250*4.6mm的规格，柱体积经计算为4.15mL，以1mL/min的流速10倍柱体积就是42min左右。以下是一些常见规格的柱体积值，可作为参考。

二、Kromasil反相C18柱的冲洗

反相C18柱是我们日常实验中应用广泛的固定相之一，首先我们先从反相C18柱的常见情况冲洗进行介绍，分别是：一般污染的冲洗、使用缓冲盐后的冲洗、生物样品分析后的冲洗。

1、一般污染的冲洗

一般污染是指的是我们每次分析使用后常见的污染情况，例如试剂和样品杂质对色谱柱产生的污染，或者是一些聚合物的形成等。

①   高比例的水相（例如：10%甲醇/乙腈-水溶液）冲洗10倍柱体积。这样可以将残留在色谱柱中的缓冲盐和一些极性化合物冲洗干净；

②   高比例的有机相（例如：80%甲醇/乙腈-水溶液）冲洗10-20倍柱体积。高比例有机相可以将一些疏水性的杂质冲洗干净；

③   如果执行上述冲洗之后还是污染问题没有被解决，可以选择异丙醇冲洗10-20倍柱体积。

2、使用缓冲盐后的冲洗

流动相中时常会加入一些缓冲盐，这些缓冲盐可能会在色谱柱中析出，导致柱压升高等问题，影响后续使用。

①   开启柱温箱，高比例的水相（例如：10%甲醇/乙腈-水溶液）冲洗20倍柱体积；

②   以未加入缓冲盐的方法起始比例流动相进行平衡。

3、生物样品污染

生物分析实验中，通常前处理较为复杂，导致样品无法处理干净。可能会残留小分子肽等物质，其会吸附在色谱柱的管壁或者筛板上，造成柱压高、峰型差、分离度降低等问题。

①   在流动相的有机相中加入0.1%的三氯乙酸，以增强对吸附蛋白质的洗脱；

②   如果问题仍未解决，可尝试在色谱柱里面进100uL三氮乙醇，尝试清洗强保留的蛋白

三、Kromasil色谱柱冲洗指南

关于其他常见色谱柱的冲洗方法，可按照以下提示进行尝试，若使用其他品牌的色谱柱请和厂商工程师确认后进行参考。

1、反相柱的冲洗

使用10倍柱体积的如下溶剂依次清洗

①   90%水-乙睛溶液

②   100%四氢呋喃

③   95%乙腈-水溶液

④   不含盐的初始比例流动相

⑤   初始比例流动相平衡

2、正相柱的冲洗-硅胶柱

使用10倍柱体积的如下溶剂依次清洗

①   异丙醇

②   甲醇

③   乙酸乙酯

④   流动相

3、正相柱的冲洗-氰基柱、二元醇基柱

使用10倍柱体积的如下溶剂依次清洗

①   三氯甲烷

②   异丙醇

③   二氯甲烷

④   流动相

色谱柱污染在日常分析中在所难免，因此可以考虑购买Kromasil保护柱来进行预防。Kromasil保护柱采用分析柱相同填料填充，不增加死体积与不改变分离的同时，可以有效保护分析柱，延长使用寿命。